M543原理
葉酸測定用培養基（又名葉酸乾酪培養基）
採用鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）為測定用菌，用於葉酸的微生物法測定。
該培養基是基於Flynn等人(1)的配方，並經Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。
用於維生素測定的培養基通常需要三種：維持培養基、接種培養基和測定用培養基。
後者通常是化學限定的培養基，包含所有測定菌生長所需的養分，但不含有待測的分子。
類似的，葉酸乾酪培養基包含鼠李糖乳桿菌生長所需的所有成分，但不包含葉酸。
因而，添加一系列濃度增加的葉酸，會觀察到鼠李糖乳桿菌生長的遞增。
鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）的
貯備菌製備是在AOAC推薦的乳桿菌瓊脂（貨號M366）試管穿刺接種培養，35-37°C孵育18-24小時後，試管儲存在冰箱裡。每月轉接一次。測定菌液的製備是將貯備菌轉種到含10ml微量維生素檢測接種肉湯（貨號M133）或乳酸桿菌肉湯（貨號M367）的試管中。 35-37°C孵育24小時後，在無菌條件下菌液離心，棄掉上清，再重懸於10ml的無菌葉酸乾酪培養基中（貨號M543）。再像之前一樣沉澱，並清洗一次。最後，清洗後的菌株重懸於10ml葉酸乾酪培養基中，並用該培養基進行1:100稀釋。 1滴重懸液用於接種到每個測定管中。也可用0.85% NaCl代替培養基來清洗和稀釋。
由於滅菌條件，孵育溫度等因素會影響標準曲線讀數，並且每次不會完全一樣，因此每次都應製備標準曲線。
10ml管內的標準品量為0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。
葉酸標準品的製備：
將20mg葉酸乾粉溶於含有20ml乙醇的100ml蒸餾水中。用0.1N NaOH調整溶液pH值為10.0，再用0.05N HCl調pH為 7.0。該溶液含有200mg葉酸/ml。用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，則濃度為200ng/ml。再用999ml葉酸緩衝液A（貨號M544）稀釋1ml該溶液，則為0.2ng/ml的葉酸標準溶液。每管取0,0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml該溶液，配置即告完成。
樣本葉酸濃度的測定步驟：
如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的製備好的血清提取物。加入5ml葉酸乾酪培養基和足量的蒸餾水，使每個試管的總體積為10ml。 15磅121°C滅菌5分鐘。冷卻試管並向每個試管中加入一滴接種液。 35-37℃孵育18-24小時後進行濁度讀數。讀數前將試管冷藏15-30分鐘以停止細菌生長。 620nm檢測吸光度。待測樣品中的葉酸含量應根據標準曲線來確定，不過要考慮樣品稀釋度。
應非常小心，避免培養基和玻璃器具被污染。應使用潔淨的無去污劑的玻璃器具。少量的外源物質的污染可能導致錯誤的結果。
M2014原理
正常人的血清葉酸水平正常為9.9ng / ml。在異常的情況下以及當身體處於患病狀態時，該水平會大大改變。 Folic Acid Casei Medium，Modified用於葉酸的微生物測定
在血清中使用乾酪乳桿菌ATCC 7469作為測試生物。該培養基基於Flynnet al（1）的配方，由Baker等人（2）和Waters和Mollin（3）修改。用於維生素測定的測試生物通常需要
三種培養基，即培養維持培養基，接種培養基和測試培養基。後者通常是化學成分確定的培養基，其含有除了研究中的材料之外的測試生物生長所必需的所有成分和營養素。類似地，Folic Acid Casei Medium，Modified含有除葉酸外的干酪乳桿菌生長所需的所有必需營養素。因此，以指定的遞增濃度添加葉酸使得生長增加相似
乾酪乳桿菌的反應。
技術
通過針刺接種乳桿菌瓊脂AOAC（M366）製備乾酪乳桿菌ATCC 7469的原種培養物。
在35-37℃溫育18-24小時後，將試管儲存在冰箱中。每月轉移一次。
通過從乾酪乳桿菌ATCC 7469的原種培養物傳代培養到含有10ml微維生素測試接種培養液（M133）或乳酸桿菌培養液（M367）的管中來製備用於測定的接種物。在35-37°C溫育24小時後，
在無菌條件下離心細胞，傾析上清液。然後將細胞重新懸浮於10ml無菌單強度葉酸Casei培養基中，如前所述再次沉澱，再洗滌一次。最後，將洗滌的細胞重懸於10ml無菌單強度葉酸Casei培養基中，改良（M2014）並用相同的培養基以1：100稀釋。將一滴該懸浮液用於接種每個測定管。可以使用0.85％NaCl代替單一強度的基礎培養基來洗滌和稀釋接種物。
應製備每個測定的標準曲線，因為影響標準曲線讀數的滅菌條件，孵育溫度等不能精確地不時重複。通過使用每個測定管（10ml）0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8和1ng水平的葉酸獲得標準曲線。
葉酸濃度的製備
將20mg乾燥的葉酸溶於100ml含20ml乙醇的蒸餾水中。用0.1N NaOH將溶液的pH調節至10.0以溶解酸，然後用0.05N HCl將pH調節至7.0。該溶液每毫升含有200微克葉酸。
用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，得到200ng / ml，最後用999ml葉酸緩衝液A（M544）稀釋1ml該溶液，得到每ml含0.2ng葉酸的標準溶液。使用0.0,0.5,1.0,2.0，
每個測定管3.0,4.0和5ml。
血清標本的保存
讓血液樣本凝結，以分離血清。將血清分離到干淨的干燥管中並離心以除去存在的任何血細胞。注意避免紅細胞溶血。將5ml血清樣品分配到干淨的干燥試管中，並向每個管中加入25mg抗壞血酸。將管冷凍至-20℃以下直至測定。
血清標本的製備
解凍含有抗壞血酸的血清。 將5ml該樣品加入45ml再水合的葉酸緩衝液A（M544）中。 將該血清 - 緩衝溶液在37℃孵育90分鐘，然後在15磅壓力（121℃）下高壓滅菌2.5分鐘。 通過離心除去凝結的蛋白質，並將上清液轉移到干淨，乾燥的管中。 獲得的這種澄清溶液用作葉酸測定中的樣品。
測定樣品中總葉酸濃度的程序
如前所述，使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的製備的血清提取物。每管加入5ml Folic Acid Casei培養基，經過改良和充足的蒸餾水，每管總體積為10ml。在15磅壓力下對管進行滅菌（121°C）5分鐘。冷卻試管並向每個試管中加入一滴接種物。應在35-37°C溫育18-24小時後進行比濁讀數。將管冷藏15-30分鐘以在閱讀前停止生長。該
濁度讀數記錄在620nm。考慮到樣品的稀釋度，可以通過用標準曲線上獲得的值解釋結果來確定測試樣品中葉酸的量。
應特別注意避免污染用於測定的培養基或玻璃器皿。應使用無洗滌劑的清潔玻璃器皿。即使是異物的少量污染也可能導致錯誤結果。
注意：L.casei現在稱為L.rhamnosus。
